Nagtapos ang Sunod-sunod na Pag-clone ng Daga Matapos ang 58 Henerasyon Habang Naiipon ang Mapaminsalang Pagbabago sa DNA

Umabot sa Hangganan ang Isang Eksperimentong Tumagal ng 20 Taon

Matapos ang 30,947 pagtatangkang maglipat ng nucleus at mahigit 1,200 daga na nagmula sa pag-clone ng iisang babae, natapos na ng isang pangkat ng mga mananaliksik sa Japan ang eksperimentong tumagal nang humigit-kumulang 20 taon. Namatay kinabukasan ang lahat ng limang dagang ipinanganak sa ika-58 henerasyon, at natapos ang sunod-sunod na prosesong inakala noon ng mga mananaliksik na maaaring magpatuloy nang walang hanggan.

Sa eksperimentong isinagawa mula 2005 hanggang 2025, natuklasan na naiipon ang mapaminsalang pagbabago sa DNA dahil sa paulit-ulit na pag-clone. Sa simula, bumuti ang tagumpay sa pagpapaanak: mula sa humigit-kumulang 7% sa unang henerasyon, umakyat ito sa 15.5% sa ika-26 na henerasyon. Nagsimula itong bumaba pagsapit ng ika-27 henerasyon at kalaunan ay umabot sa 0.6%, o humigit-kumulang anim na ipinanganak sa bawat 1,000 embryo na na-clone at inilipat sa mga kahaliling ina.

Nalathala ang mga natuklasan sa Mga Limitasyon ng Sunod-sunod na Pag-clone, sa Nature Communications. Kabilang sa mga mananaliksik sina Associate Professor Sayaka Wakayama at Professor Teruhiko Wakayama, direktor ng Advanced Biotechnology Center ng University of Yamanashi, ayon sa anunsyo ng pananaliksik ng unibersidad.

Pinakamalinaw na ipinakita ng mga resulta ang pagkakaiba ng hitsura at kakayahang magparami. Marami sa mga daga sa sunod-sunod na lahi ang mukhang malusog at nabuhay nang humigit-kumulang dalawang taon, ngunit lalong naging mahirap paramihin ang mga sumunod na henerasyon, sa pamamagitan man ng pag-clone o karaniwang pagpaparis.

Inilarawan ni Teruhiko Wakayama, isang nangunguna sa pag-clone ng daga sa University of Yamanashi, ang tanong sa likod ng eksperimento sa pamamagitan ng isang pamilyar na paghahambing:

Bahagyang bumababa ang kalidad ng larawan kapag kinopya ito gamit ang photocopier. Lalo pang bumababa ang kalidad kapag kinopya muli ang kopyang iyon,

Sa mga daga, kabilang sa mga pagbabago ang mga pagbabago sa indibidwal na letra ng DNA at sa mas malalaking bahagi ng mga chromosome. Iniuugnay ng pananaliksik ang pag-iipon ng mga pagbabagong ito sa tuluyang pagbagsak ng bilang ng matagumpay na panganganak.

Paano Nag-clone ang mga Mananaliksik ng Na-clone Nang Daga

Gumamit ang pangkat ng somatic cell nuclear transfer. Ang somatic cell ay selula ng katawan, hindi itlog o semilya. Inalis ng mga mananaliksik ang nucleus, na naglalaman ng karamihan sa mga tagubiling henetiko ng selula, at inilipat ito sa isang hindi pa napepertilisang itlog na inalisan ng sariling nucleus.

Kinailangan ng itlog na i-reset ang mga tagubiling iyon upang mapangasiwaan ng nucleus mula sa selula ng katawan ng isang adultong daga ang pagbuo ng embryo. Inilipat ng mga mananaliksik ang mga nabuong embryo sa mga kahaliling ina at gumamit ng mga selula mula sa mga clone na nakaligtas upang likhain ang susunod na henerasyon.

Nagmula ang mga donor cell sa mga cumulus cell, na pumapalibot at sumusuporta sa mga itlog. Ang orihinal na donor ay isang babaeng daga na may agouti na balahibo, isang kulay na nalilikha ng mga banda ng pigment sa bawat hibla ng balahibo. Pawang babae ang mga na-clone na daga at magkakapareho ang kulay ng kanilang balahibo.

Nakalikha ang mga mananaliksik ng humigit-kumulang tatlo hanggang apat na henerasyon bawat taon. Sa halip na direktang gumawa ng bawat daga mula sa nakaimbak na mga selula ng orihinal na donor, paulit-ulit nilang ipinadaan ang lahi sa isang bagong na-clone na hayop. Dahil dito, nasubaybayan nila ang mga pagbabagong naipapasa mula sa isang henerasyon patungo sa kasunod.

Bakit Nangako ang mga Maagang Resulta

Inilarawan sa anunsyo ng RIKEN noong Marso 2013 ang isang eksperimentong tila patuloy na umuusad nang mabuti. Nakalikha ang pangkat ng 581 daga sa loob ng 25 henerasyon nang isumite ang papel, at 598 daga sa loob ng 26 na henerasyon nang ilabas ang anunsyo.

Gumamit ang mga mananaliksik ng trichostatin A, o TSA, isang gamot na tumutulong mag-reset sa aktibidad ng mga gene sa inilipat na nucleus. Hanggang humigit-kumulang anim na henerasyon lamang ang naabot ng mga naunang pagtatangka sa paulit-ulit na pag-clone ng daga. Sa tulong ng TSA at mas pinahusay na mga kundisyon ng eksperimento, tumaas ang tagumpay sa panganganak sa halip na patuloy na bumaba.

Nakapagbigay rin ng kapanatagan noon ang mga sukat sa kalusugan, pertilidad, haba ng buhay at mga dulo ng chromosome. Dahil dito, naniwala ang mga mananaliksik na maaaring magpatuloy nang walang hanggan ang proseso. Ngunit nang subaybayan pa ang parehong lahi sa loob ng isa pang dekada, lumitaw ang mga problemang hindi nakita sa unang 25 henerasyon.

Ipinakikita ng mahahalagang yugto kung paano nagbago ang konklusyon:

• 2005: Nagsimula ang sunod-sunod na pag-clone. Itinakda ng huling papel ang simula nito sa Enero, samantalang ayon sa ulat ng RIKEN noong 2013, nagsimula ito sa bandang huli ng taon.
• Marso 8, 2013: Inanunsyo ng RIKEN ang 598 daga sa loob ng 26 na henerasyon, at umabot sa humigit-kumulang 15% ang tagumpay sa panganganak.
• Mula ika-27 henerasyon: Nagsimulang tuluy-tuloy na bumaba ang tagumpay sa panganganak, sa kabila ng pagkakaiba-iba sa bawat henerasyon.
• 2025: Natapos ang eksperimento sa ika-58 henerasyon matapos mamatay kinabukasan ang lahat ng limang dagang ipinanganak sa henerasyong iyon.

Ano ang Nagbago sa Loob ng DNA?

Natuklasan sa genome sequencing ang humigit-kumulang 3,700 single nucleotide variant at 80 maliliit na pagpasok o pagkakabura ng bahagi ng DNA sa pagitan ng una at ika-57 henerasyon. Ang single nucleotide variant, o SNV, ay pagbabago sa isang letra ng DNA sequence. Ang insertion o deletion naman ay pagdaragdag o pagtanggal ng maliit na bahagi ng sequence na iyon.

Kinalkula sa papel ang mga karaniwang bilang na 69.4 SNV at 1.4 maliliit na insertion o deletion bawat henerasyon. Maliit ang epekto ng maraming pagbabago sa DNA, ngunit may ilan na nakagagambala sa mga tagubiling kailangan para sa normal na pag-unlad o pagpaparami.

Bilang paghahambing, sinuri ng mga mananaliksik ang dalawang linya ng daga na pinarami sa loob ng 60 henerasyon sa pamamagitan ng pagpaparis ng magkakapatid, sa loob ng humigit-kumulang 20 taon. Nakapag-ipon ang mga linyang iyon ng karaniwang 22.3 SNV bawat henerasyon. Samakatuwid, humigit-kumulang 3.1 beses na mas mataas ang bilang sa linya ng mga na-clone, batay sa paghahambing ng 69.4 at 22.3.

Tumaas din ang bahagdan ng maliliit na variant na inaasahang makagagambala o makapagbabago sa mga protina. Mula 0.52% ito sa mga pagbabagong lumitaw sa pagitan ng una at ika-23 henerasyon, at naging 1.19% sa mga pagbabagong lumitaw sa pagitan ng ika-23 at ika-57 henerasyon.

Muli ring binuo ng mga mananaliksik ang family tree ng mga daga mula sa kanilang DNA. Tumugma ito sa naitalang lahi sa eksperimento, na nagpatunay na nanatiling nagmula sa orihinal na donor ang buong sunod-sunod na lahi sa kabuuan ng eksperimento.

Nagdagdag sa Problema ang Mas Malalaking Pagbabago sa Chromosome

Hindi lamang pagbabago sa mga indibidwal na letra ng DNA ang naipon sa mga daga. Natukoy sa sequencing ang humigit-kumulang 80 hanggang 84 na bagong structural variant sa pagitan ng una at ika-57 henerasyon. Tumutukoy ang mga ito sa mas malalaking pagbabago sa ayos o dami ng DNA.

Kabilang sa 16 na malalaking variant ang mga bahaging may hindi bababa sa 40,000 letra ng DNA. Kabilang sa mga pagbabago ang pagkawala ng isang X chromosome, malaking pagbabago sa chromosome apat at pagpapalitan ng materyal sa pagitan ng chromosome pito at siyam.

Pagsapit ng ika-57 henerasyon, tinaya ng mga mananaliksik na humigit-kumulang 30 mutasyon ang nagdulot ng pagkawala ng paggana ng mga gene, at mga 50 naman ang nagbago sa mga tagubilin para sa mga protinang naka-encode sa mga gene, bago pa isama ang pagkawala ng isang X chromosome. Naapektuhan din ng dalawang malalaking deletion ang iisang rehiyon at inalis ang paggana ng dalawang kopya ng isang gene na tinatawag na Csmd1.

Iniuugnay ng mga may-akda ang pagbaba ng bilang ng mga ipinanganak sa pinagsama-samang epekto ng mga mutasyon. Ayon sa kanilang paliwanag, itinulak ng mga karagdagang mapaminsalang pagbabago sa dulo ng eksperimento ang dati nang lubhang nabagong genome lampas sa kayang tiisin ng mga umuunlad na daga.

Hindi pa natutukoy ang pinagmulan ng mas mataas na bilang ng mutasyon. Maaaring may ambag ang paulit-ulit na paglilipat ng nucleus mula sa mga selula ng katawan, at maaaring mag-ipon ng mutasyon ang mga selula ng katawan habang nabubuhay ang hayop. Binabago rin ng kawalan ng karaniwang seksuwal na reproduksiyon kung paano naipapasa ang mga mutasyong ito sa mga susunod na henerasyon.

Bakit Hindi Sapat ang Pag-reset sa Aktibidad ng Gene

Hindi sapat ang paglilipat lamang ng DNA sa isang itlog upang makapag-clone. Kailangan ding i-reset ng itlog ang mga kemikal na marka na tumutulong magtakda kung aling mga gene ang aktibo. Tinatawag na epigenetic ang mga markang ito dahil kinokontrol ng mga ito ang paggamit sa DNA nang hindi binabago ang sequence nito.

Hinala noon ng mga mananaliksik na maaaring lumala sa bawat pag-clone ang mga pagkabigo sa proseso ng pag-reset na ito. Sa halip, ipinahiwatig ng kanilang mga sukat na ang naiipong mutasyon sa DNA ang pangunahing paliwanag sa pagbaba sa mga huling henerasyon.

Lumaki ang mga placenta ng mga na-clone na daga, na isang kilalang katangian ng pag-clone ng daga. Sa kabuuan ng eksperimento, may karaniwang timbang na humigit-kumulang 0.30 gramo ang mga placenta, kumpara sa 0.11 gramo sa mga control na nabuo sa pamamagitan ng in vitro fertilization. Gayunman, hindi patuloy na tumaas ang timbang ng mga ito sa bawat sumunod na henerasyon.

Nagpakita rin ng halos magkatulad na padron ang mga pagsusuri sa ilang epigenetic mark sa mga unang embryo ng bagong likhang clone at ng mga clone sa ika-51 henerasyon. Patuloy na nakatulong ang TSA: 5.4% ang tagumpay sa panganganak sa ika-51 henerasyon nang gumamit nito, kumpara sa 1.6% nang hindi ito ginamit.

Isa pang posibleng paliwanag ang telomere, ang mga proteksiyon na sequence ng DNA sa mga dulo ng chromosome. Kaunti ang nakitang suporta sa mga sumunod na pagsusuri ng sequencing para sa malaking pag-iksi ng mga ito sa mga henerasyong sinuri. Sa kabuuan, itinuro ng mga pagsusuri ang dumaraming pagbabago sa sequence ng DNA at estruktura ng chromosome.

Mas Kaunti ang Anak ng mga Daga Kahit Mukha Silang Malusog

Ipinakita ng karaniwang pagpaparis ang paghina ng reproduksiyon na madaling hindi mapansin batay lamang sa hitsura ng mga daga. Nagluwal ang mga babaeng daga sa ika-20 henerasyon ng karaniwang 9.9 anak bawat panganganak nang iparis sa mga normal na lalaki, malapit sa 10.3 na naitala sa control group.

Bumaba ang karaniwang laki ng bawat panganganak sa 2.8 anak sa ika-50 henerasyon at 2.2 sa ika-55. Humigit-kumulang 79% na mas mababa ang huling bilang kaysa sa karaniwang 10.3 sa control group, batay sa paghahambing ng 2.2 at 10.3 anak.

Hindi bumaba ang bilang ng mga nakolektang itlog matapos pasiglahin ng hormone habang sumusulong ang mga henerasyon ng pag-clone. Kaya sinuri ng mga mananaliksik kung ano ang nangyari sa mga itlog matapos i-activate o pertilisahin ang mga ito.

Nang pertilisahin sa laboratoryo ang mga itlog gamit ang semilya mula sa mga normal na lalaki, umabot sa yugto ng blastocyst ang 97.6% ng mga control embryo. Maagang yugto ito bago ang pagtatanim sa matris. Naging 39.7% ang bahagdan para sa mga itlog mula sa mga clone sa ika-25 henerasyon, at 20.3% naman sa mga itlog mula sa ika-53 henerasyon.

Sa mga eksperimentong gumamit ng itlog mula sa ika-56 henerasyon, natuklasan ang mga problema sa nucleus at sa cytoplasm, ang materyal na nakapalibot dito. Napakababa pa rin ng bilis ng pag-unlad kahit palitan ang alinman sa dalawang sangkap ng katumbas nito mula sa control na itlog. Lumitaw na parehong may diperensiya ang dalawang bahagi ng itlog.

Naibalik ng Seksuwal na Reproduksiyon ang Bahagi ng Pagkamayabong

Nakaligtas at mas matagumpay na nakapagparami ang ilan sa mga supling ng mga huling henerasyon ng clone. Bagaman karaniwang 2.2 anak bawat panganganak ang iniluwal ng mga babaeng clone sa ika-55 henerasyon, nang maglaon ay nagluwal ang kanilang mga supling ng karaniwang 7.0 anak, mahigit tatlong beses na mas marami.

Malapit din ang laki ng mga placenta ng mga apong ito sa mga mula sa mga embryo na nabuo sa pamamagitan ng pertilisasyon, hindi tulad ng lumalaking mga placenta na karaniwan sa mga na-clone na daga.

Muling pinagsasama-sama ng seksuwal na reproduksiyon ang henetikong materyal habang nabubuo ang mga itlog at semilya, at pinagsasama ito sa DNA mula sa isa pang magulang sa oras ng pertilisasyon. Kung minsan, kayang tumbasan ng gumaganang kopya ng gene mula sa isang magulang ang nasirang kopya mula sa kabila. Maaaring huminto sa pag-unlad ang mga embryo na may malulubhang suliraning henetiko, samantalang nabubuhay ang mga may kayang pagsamahin ng mga gene.

Namana pa rin ng mga inapo ang mga mutasyon mula sa mga babaeng na-clone. Natuklasan sa genome sequencing ang mga variant sa mga anak at apo, kabilang ang pagpapalitan sa pagitan ng chromosome pito at siyam. Iminungkahi ng mga mananaliksik na namana nang magkasama ang dalawang nabagong chromosome, kaya nanatiling balanse ang palitan.

Samakatuwid, ipinahihiwatig ng pagdami ng anak sa bawat panganganak na bahagyang bumuti ang kakayahang magparami sa pamamagitan ng seksuwal na reproduksiyon. Mas mahusay nang nakapagparami ang mga inapo habang taglay pa rin ang ilan sa mga pagbabagong henetiko na naipon sa pag-clone.

Kahulugan Nito sa Konserbasyon at Pagsasaka

Interesado ang mga tagapagtaguyod ng konserbasyon sa pag-clone dahil maaaring mapanatili ng mga nakaimbak na selula ang henetikong materyal mula sa mga hayop na patay na o hindi na kayang magparami. Sa pagsasaka, nag-aalok ito ng paraan para paramihin ang mga hayop na may mahahalagang katangian. Ipinakikita ng eksperimento kung bakit kailangang bigyang-pansin sa mga gamit na ito ang kalagayan ng DNA ng donor at ang kalusugan ng reproduksiyon ng mga inapo.

Tumutukoy ang natuklasan sa paulit-ulit na pag-clone sa mahabang sunod-sunod na lahi ng mga donor. Ang 58 henerasyon ang dulo ng partikular na lahing ito ng daga sa ilalim ng mga kundisyon ng eksperimentong ito; hindi pa alam kung ilang henerasyon ang posibleng marating ng ibang lahi o uri ng mamalya.

Ayon kay Katarzyna Malin, isang developmental endocrinologist sa University of California, Davis na hindi kabilang sa pananaliksik, mas pinapaboran ng mga natuklasan ang konserbasyong pumipigil sa mga species na umabot sa krisis, sa halip na umasa sa pag-clone upang iligtas ang mga ito pagkatapos.

Binigyang-diin ni Ben Novak ng organisasyong pangkonserbasyon na Revive & Restore ang kahalagahan ng mga mutasyong naiipon sa mga tisyu ng katawan habang nabubuhay ang hayop. Taglay ng donor cell ang sarili nitong kasaysayan ng mga pagbabago sa DNA, at mahalaga ito kapag ginawa ang selulang iyon na panimulang batayan para sa isa pang hayop.

Pinagsasama ng pag-aaral ang dalawang praktikal na aral. Kayang panatilihin ng pag-clone ang kakayahang gumamit ng henetikong materyal ng isang hayop sa maraming henerasyon, ngunit nakasalalay rin sa mga pagbabagong nangyayari sa DNA sa paglipas ng panahon ang pagpapanatili ng malulusog na inapo. Sa eksperimentong ito, nakapagparami muli ang ilan sa mga inapo matapos umabot sa dulo ang sunod-sunod na pag-clone.

Mahahalagang Punto

• Gumawa ang mga mananaliksik ng 30,947 pagtatangkang maglipat ng nucleus at nakalikha ng mahigit 1,200 daga mula sa iisang orihinal na babae sa pamamagitan ng sunod-sunod na pag-clone.
• Nanguna sa 15.5% ang tagumpay sa panganganak sa ika-26 na henerasyon, saka bumaba sa 0.6% malapit sa dulo ng eksperimento.
• Namatay kinabukasan ng kapanganakan ang lahat ng limang daga sa ika-58 henerasyon, kaya natapos ang sunod-sunod na lahi noong 2025.
• Humigit-kumulang tatlong beses na mas maraming pagbabago sa iisang letra ng DNA bawat henerasyon ang naipon sa lahi ng mga na-clone kaysa sa mga linya ng paghahambing na pinarami sa pamamagitan ng pagpaparis ng magkakapatid.
• Naiipon ang mapaminsalang mutasyon sa DNA at malalaking pagbabago sa chromosome, samantalang hindi unti-unting lumala ang mga epigenetic abnormalidad na sinukat.
• Pinahusay ng seksuwal na reproduksiyon ang kakayahang magparami ng ilang inapo, bagaman nanatili sa kanila ang mga namana nilang mutasyon.